使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位點(diǎn)與脫靶結(jié)合位點(diǎn)[5]
基于機(jī)器學(xué)習(xí)翻譯，僅供參考。
練習(xí)4：找到配對(duì)的CRISPR位點(diǎn)
一種提高CRISPR / Cas9靶向特異性的方法是使用突變體Cas9-D10A切口酶以及與靶位點(diǎn)的相對(duì)鏈互補(bǔ)的一對(duì)引導(dǎo)RNA。相反鏈上的兩個(gè)單獨(dú)切口模擬雙鏈斷裂，然后導(dǎo)致非同源末端連接。脫靶相互作用被最小化，因?yàn)槿魏螁蝹€(gè)脫靶切口將通過(guò)堿基切除修復(fù)途徑以更高的保真度被修復(fù)。
在本練習(xí)中，您將使用Find CRISPR Sites在LYP1 CDS上查找配對(duì)位點(diǎn)。選擇LYP1 CDS文檔（geneious的demo數(shù)據(jù)文件，可以下載）并轉(zhuǎn)到克隆→查找CRISPR位點(diǎn)。
和前面的練習(xí)保持相同的設(shè)置，除了設(shè)置速度和過(guò)濾策略上慢-評(píng)分所有的位點(diǎn)，因?yàn)槲覀兿?/font>進(jìn)行評(píng)分所有位點(diǎn)的這項(xiàng)工作。
要找到配對(duì)的CRISPR位點(diǎn)，請(qǐng)勾選Pair CRISPR sites旁邊的復(fù)選框。您可以指定返回位點(diǎn)的最大允許重疊，以及配對(duì)位點(diǎn)之間允許的最大空間。位點(diǎn)之間的最大重疊和最大空間從CRISPR位點(diǎn)的5'，PAM遠(yuǎn)端測(cè)量。我們將分別使用默認(rèn)選項(xiàng)6和16。
對(duì)話(huà)框現(xiàn)在應(yīng)該如下圖所示。點(diǎn)擊確定運(yùn)行搜索。
Geneious已經(jīng)注釋了三對(duì)CRISPR位點(diǎn)。
當(dāng)使用Pair CRISPR位點(diǎn)選項(xiàng)時(shí)，Geneious將只注釋至少有一對(duì)位點(diǎn)給定位點(diǎn)設(shè)置之間的最大重疊和最大空間。在這些設(shè)置中沒(méi)有配對(duì)的位點(diǎn)沒(méi)有注釋。
每對(duì)CRISPR位點(diǎn)都有一個(gè)“配對(duì)的CRISPR評(píng)分”。如果您將鼠標(biāo)放在其中一個(gè)CRISPR注釋上，則可以查看該位點(diǎn)的配對(duì)CRISPR分?jǐn)?shù)。這個(gè)綜合分?jǐn)?shù)是兩個(gè)CRISPR分?jǐn)?shù)的平均值。具有最高綜合得分的CRISPR位點(diǎn)對(duì)相關(guān)聯(lián)。每個(gè)CRISPR位點(diǎn)都將鏈接到其得分最高的配對(duì)位點(diǎn)，除非該第二個(gè)位點(diǎn)與另一個(gè)位點(diǎn)的得分更高。這對(duì)位點(diǎn)根據(jù)他們的配對(duì)分?jǐn)?shù)進(jìn)行著色，而不是他們各自的CRISPR分?jǐn)?shù)。
恭喜，你現(xiàn)在已經(jīng)完成了CRISPR教程。完結(jié)。